muestra biológica (Técnico)

Autor: ENRIQUE DE ÁLAVA CASADO

I. Definición y concepto.—Según la Ley de Investigación Biomédica (Art. 3 o) Muestra biológica es «cualquier material biológico de origen humano susceptible de conservación y que pueda albergar información sobre la dotación genética característica de una persona».
Se trata por tanto de materiales como orina, sangre, tejido, células, ADN, ARN y proteínas de seres humanos, animales o plantas. Las muestras biológicas se almacenan en un biobanco y/o forman parte de una colección con fines de investigación o diagnóstico. Esto supone complejos procedimientos para su selección, extracción, etiquetado, almacenamiento, cesión y envío a los investigadores, que describiremos posteriormente.
Es muy importante señalar que esas muestras pueden (y deben) ir unidas a información correspondiente al sujeto fuente. Esta información puede tener dos fuentes: i) la propia muestra biológica a partir de los análisis genéticos realizados sobre la misma, y ii) la información generada durante actos médicos a los que se someta el sujeto fuente (p.ej. cuestionarios epidemiológicos, exploración física, otras pruebas diagnósticas). Por tanto, desde el punto de vista de la gestión de la información las muestras pueden estar asociadas o no a una persona identificada o identificable, y esta asociación puede haberse mantenido desde la toma de la muestra (muestra identificada o codificada), puede haberse roto desde el momento de la obtención de la muestra (muestra anónima), o bien la muestra ya obtenida y/o almacenada se somete a un procedimiento por el que deja de estar asociada a una persona identificada o identificable (muestra anonimizada) (Art 3, p-r).

II. Estado de la cuestión. 2.1. Necesidad de muestras biológicas.—Cada vez más y, en especial a partir de los enormes avances de la Genómica, Proteómica y Transcriptómica, el disponer de muestras humanas debidamente registradas y almacenadas se ha convertido en una imperiosa necesidad para la investigación biomédica. Las muestras son además soporte de información genética que, analizada mediante análisis genéticos complejos permite una caracterización precisa de la enfermedad, así como el desarrollo y validación de nuevos marcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos de la respuesta al tratamiento. Para la investigación médica más aplicada al campo clínico, el uso de muestras biológicas almacenadas en biobancos es por tanto un recurso logístico de interés capital.
2.2. Origen y selección de las muestras.— Muchas muestras biológicas provienen de actos de asistencia médica rutinaria y de restos (desechos) de muestras obtenidas para la realización de pruebas diagnósticas (p.ej. biopsias o citologías) o terapéuticas (p.ej. donaciones de tejidos para trasplante).
Si el paciente lo consiente, estas muestras pueden tener un uso secundario en investigación. En otras ocasiones se produce una toma de muestra ex profeso en el seno de una donación cuya finalidad directa es la investigación, y que se almacena ya sea en el seno de biobancos poblacionales o en el de ensayos clínicos.
La determinación del tipo de muestras que se precisan en la investigación es un primer paso fundamental para que el proceso de utilización posterior sea ágil y racional.
Por ello es recomendable que cada biobanco establezca, con antelación y basado en sus objetivos, los criterios de selección de muestras biológicas de entre aquellas en las que:
a) Exista material excedente de estudios diagnósticos o sea posible una toma de muestra ex profeso.
b) Se cuente con consentimiento informado expreso y escrito del paciente y
c) La muestra se ajuste a los requisitos de calidad previamente definidos.
Estos criterios se relacionan típicamente con el interés y finalidad del banco o de los grupos que utilizan o se prevé utilizarán las muestras almacenadas. Aunque el criterio empleado puede ser en principio el de almacenar todas las muestras que, cumpliendo los criterios anteriores, lleguen al banco, hay que tener en consideración que el mantenimiento de un archivo con escasa utilización supone un coste variable que, dependiendo de los formatos en los que se archiven las muestras, puede suponer una sobrecarga económica importante para la institución.
2.3. Obtención de las muestras. 2.3.1. Tejidos.— La calidad de las muestras depende en gran medida de la rapidez y forma de obtención, así como del procesamiento y tipo de transporte hasta llegar al biobanco de tejidos. Además, debido a la enorme variabilidad biológica, algunos tipos de tejidos y de tumores pueden necesitar un tratamiento individualizado. Estas variables son especialmente importantes cuando se pretende la extracción y posterior uso de ARN. Por ello, es recomendable un inmediato traslado de las muestras, en especial las obtenidas por procedimientos quirúrgicos, punciones y biopsias, desde el lugar de obtención hasta el Servicio en el que se van a realizar los estudios diagnósticos (Por ej: Anatomía Patológica o Hematología) donde se realizará la toma de la parte de la muestra excedente de diagnóstico para archivo en el banco de tejidos. Esto requiere la coordinación con el personal que realizará el traslado de las muestras. El envío de las muestras una vez obtenidas debe hacerse preferentemente en condiciones de esterilidad y en fresco.
Se debe establecer un máximo de tiempo desde la extracción quirúrgica a la congelación, a partir del cual el material se rechazará. Este tiempo puede variar con el tipo de tejido y con el objetivo para el cual se ha obtenido (extracción de ARN, ADN, proteínas, histología, etc.). Como regla general, toda muestra que haya tardado más de 2 horas y haya estado a temperatura ambiente debe ser descartada. En caso de extraer ARN el estándar de calidad es de menos de 30 minutos.
La toma de muestras biológicas de tejidos para un biobanco no puede interferir ni con el diagnóstico histopatológico, citomorfológico, fenotípico o molecular del caso ni con el uso para otro tipo de fines primordiales para el paciente como la evaluación de parámetros pronósticos; en otras palabras sólo podrán utilizarse para el archivo el material excedente del utilizado para los fines anteriormente citados.
2.3.2. Células.—Un primer paso para la obtención de células ex vivo consiste en obtener una suspensión de células individualizadas. En los casos en que la muestra proceda de fluidos corporales (sangre, orina, liquido peritoneal, etc.) las células se encuentran ya en suspensión y no es necesaria su preparación. Para la preparación de suspensiones de tejidos sólidos contamos con métodos físicos y enzimáticos. Una vez obtenida la suspensión celular del tejido, existen diferentes métodos para aislar o enriquecer las células de interés. En primer lugar, debe decidirse la pureza del tipo celular concreto que se necesita para la finalidad que se desea. Es necesario, igualmente, evaluar la importancia de la presencia en la muestra final de otros tipos celulares no deseados presentes en el tejido inicial, que pueden quedar como «contaminantes» y alterar o entorpecer nuestros objetivos. Para separar las células de interés contamos con:
a) Métodos físicos: centrifugaciones
b) Parámetros fisiológico
c) Aislamiento de células observadas al microscopio: microdisección por láser
d) Utilización de la expresión diferencial de moléculas superficiales: técnicas de inmunomarcaje, ya sea mediante:
— El empleo de anticuerpos o reactivos conjugados a sustancias fluorescentes que son analizadas en un citómetro separador que permite la separación de las células en función de este análisis.
— El empleo de anticuerpos unidos a partículas magnéticas que son retenidas en un campo magnético.
2.3.3. Fluidos.—Los fluidos o líquidos orgánicos más habituales que pueden ser utilizados en un biobanco son:
1. Sangre total: Plasma y Suero
2. Pleural
3. Pericárdico
4. Ascítico
5. Cefalorraquídeo
6. Sinovial
Cada uno de estos líquidos tiene un sistema peculiar de obtención que requiere habilidad y que debe ser realizado por personal entrenado para ello pues su incorrecta realización puede poner en peligro la vida de los pacientes. Cada tipo de muestra requiere procedimientos técnicos individualizados para su preparación y conservación.
2.4. Preparación de las muestras.—La muestra biológica original, obtenida según lo descrito en el apartado 2.3 sufre diversos procesos de manipulación gracias a los cuales se extraen ciertos componentes útiles para la realización los análisis genéticos. Nos detendremos en:
2.4.1. ADN.—Para análisis genéticos y moleculares en Biomedicina se puede utilizar tanto el ADN como el ARN. En cuanto al ADN conviene recordar que hay dos tipos de mutaciones: mutaciones germinales, que están en todas las células y se transmiten a la generación siguiente y las mutaciones somáticas que no se transmiten y suelen aparecer de novo en un individuo y en algún tipo celular del mismo. De ahí que es importante conocer en cada caso, no sólo cuál es la molécula de elección, sino también cuál es la muestra más adecuada para obtener esa molécula. Además hoy en día, en la mayoría de análisis se parte de la PCR o reacción en cadena de la polimerasa, capaz de amplificar el ADN de una sola célula. Esta extraordinaria sensibilidad introduce un riesgo de contaminación por otra muestra de otra procedencia, por lo que es necesario de forma general una esterilidad rigurosa y un cuidado exquisito en la manipulación de las mismas.
Para la extracción del ADN se cuenta con las células nucleadas de la sangre para extraer el ADN genómico, ya que son las de más fácil acceso y proporcionan un ADN abundante y de alta calidad. De preferencia, la sangre ha de ser total, sin haber separado sus componentes, y sin coagular, lo que se consigue colocándola en tubos con el anticoagulante EDTA. Una alternativa a la sangre fresca es la extracción de ADN de células sanguíneas a partir de sangre seca conservada en las llamadas «Guthrie Cards». Desde hace más de 10 años, este tipo de muestras se han utilizado sobre todo en los estudios de cribado neonatal. Otras fuentes posibles de ADN son: las células epiteliales bucales mediante raspado del interior de la boca o centrifugado de un enjuague bucal o las raíces de cabello.
Sólo en el caso de querer estudiar mutaciones somáticas, en las que un sólo tejido está alterado, es necesario extraer el ADN genómico del propio tejido afectado (por ejemplo en algunos tumores), ya que en sangre total no detectaríamos la mutación. Este es el caso también de los aspirados de médula ósea utilizados en Hematología. Pero también se consigue aislar ADN de manera satisfactoria, a partir de especimenes patológicos históricos conservados en parafina, así como de muestras en formol y hasta momificadas, para estudios antropológicos. La calidad del ADN que se obtiene en estos casos de los tejidos depende de la edad del tejido y de las condiciones de conservación.
Hay que mencionar aparte las muestras fetales utilizadas para Diagnóstico prenatal. La biopsia de vellosidades coriales, al ser de origen fetal, es la mejor fuente de ADN de un feto. La extracción de vellosidades coriales la hacen los ginecólogos guiados por la ecografía. También se pueden utilizar las células contenidas en el líquido amniótico extraído por medio de una amniocentesis o punción transabdominal ecoguiada. Como no son abundantes se suelen cultivar, lo que ralentiza el estudio prenatal y de ahí su menor uso.
Para la preparación del ADN se han desarrollado muy diversos protocolos, que se pueden llevar a cabo usando tanto sistemas automáticos como manuales.
2.4.2. ARN.—El ARN mensajero se encuentra sólo en aquellos tejidos en los que se expresa así que, si queremos estudiar cómo una mutación incide en la funcionalidad de una célula tendremos que acudir al órgano específico. De ahí, que debemos saber extraer ARN de todo tipo de tejidos aunque muchos genes se expresan también en sangre periférica. Hay que tener en cuenta una particularidad muy especial del ARN: la facilidad de degradación enzimática de esta molécula por medio de ribonucleasas. De ahí que las precauciones que se han de tomar a la hora de extraer una muestra para ARN hayan de ser extremas.
2.4.3. Células.—Los cultivos celulares con una capacidad de proliferación más larga o ilimitada se establecen con células que muestran mayor capacidad de renovación como las células tumorales o aquellas que son «inmortalizadas» mediante transformación por tratamiento químico o infección viral. En este último caso se pueden inmortalizar los leucocitos de la sangre, lo que permite obtener una fuente inagotable de ADN del sujeto fuente.
2.5. Conservación de las muestras biológicas.— Los sistemas y formatos de archivo de muestras biológicas en el biobanco son variados (tubos, bloques de tejido embebidos en material crioprotector, secciones congeladas, frotis o improntas congeladas, bloques de parafina, matrices de tejido, u órganos enteros, como es el caso de los cerebros en los bancos de tejido neurológico). Idealmente sería bueno disponer en todos los casos de muestras archivadas en diferentes formatos debido a que, habitualmente, a las ventajas de cada formato de archivo se asocian también algunas limitaciones o inconvenientes. Los lugares donde residen los sistemas de archivo deberán tener un control físico de acceso, ya sea mediante cerradura o candado, o mediante identificación por tarjeta magnética de las personas que entren a dichos lugares. A continuación se describen estos sistemas y formatos de archivo agrupándolos en sistemas de archivo a temperatura ambiente y sistemas de congelación:
2.5.1. Sistemas de archivo a temperatura ambiente:— Se trata de láminas con improntas y extensiones, o tejido incluido en parafina. Este tipo de muestras se almacenan de forma que no queden expuestas a luz, polvo y cambios de temperatura. Se debe procurar no contaminar por la manipulación sin guantes.
2.5.2. Sistemas de archivo a bajas temperaturas:— Habitualmente para la realización de diferentes tipos de estudios retrospectivos sobre material archivado, relacionados con el análisis de ADN, ARN u otros componentes celulares se requiere que la muestra haya sido preservada a bajas temperaturas. Aunque en términos generales a menor temperatura hay una mayor garantía de calidad de la muestra, la selección de la temperatura a la que debe archivarse viene determinada por lo que se pretende estudiar a posteriori sobre ese espécimen en concreto. En cualquier caso, en general se recomienda el empleo de arcones de –80C (o temperaturas inferiores) y congeladores de nitrógeno líquido a temperaturas muchos más bajas. En este último caso, el mantenimiento de las células almacenadas en fase gaseosa evitaría al máximo la posibilidad de contaminación cruzada entre diferentes muestras. En cualquier caso, es imprescindible, sea cual sea el equipo empleado, que disponga de los adecuados sistemas de seguridad que garanticen la preservación de muestras: alarmas de temperatura y corriente eléctrica, generadores de emergencia, etc. Estas alarmas deben estar conectadas a una central que en caso de problemas avise a los encargados del biobanco en el mismo momento de producirse. En los equipos con suministro de N2 líquido así como en los arcones debe existir un sistema de apoyo («back-up») para suplir posibles deficiencias en su funcionamiento, es también conveniente tener localizados otros contenedores con espacio libre dentro de la institución para casos de extrema emergencia.
Cualquiera que sea el equipo, las muestras deben estar bien organizadas dentro del mismo. Esto se consigue por medio de cajas dispuestas de forma ordenada en estantes («racks»). El etiquetado e identificación de muestras biológicas tiene como objetivo asegurar de forma inequívoca la procedencia y características específicas de cada una de ellas y es un factor importante para asegurar la trazabilidad de las muestras. Con ello se busca controlar al máximo los posibles errores o ambigüedad en la identificación o incluso evitar la necesidad de realizar procedimientos adicionales sobre la muestra para conocer algunas de sus características que han sido previamente exploradas (Por ej: tejido de procedencia, riqueza en células tumorales).
2.6. Circulación de las muestras biológicas.— Todos los laboratorios que reciban o envíen muestras biológicas deben cumplir la normativa vigente y garantizar, como elementos básicos, las tres premisas siguientes:
1) identificación y garantía de trazabilidad de las muestras y las solicitudes.
2) formación adecuada del personal que debe manipular y transportar las muestras para garantizar sus características originales.
3) definición de las condiciones de preparación, manipulación y transporte que requiere cada tipo de muestra
2.7. Cesión de muestras para investigación.— El acceso de los investigadores de las muestras biológicas y sus datos asociados está estrictamente regulado. Los biobancos están diseñados para facilitar este acceso. Aunque el procedimiento se describe con detalle en la voz dedicada a biobancos, éste tiene ciertas premisas:
a) El proyecto debe tener calidad científica adecuada y dotación económica suficiente que aseguren la viabilidad del proyecto. Este requisito lo verifica el comité científico externo del biobanco.
b) El proyecto debe respetar los principios éticos, en particular asegurarse de que la voluntad del sujeto fuente se respeta a la hora de realizar la investigación.
El comité de ética de la investigación se asegura de la adecuación a este requisito.
c) La cesión, como su nombre indica, es gratuita para el investigador, aunque en muchos países se considera lícito repercutir parcialmente los costes de preparación o envío de la muestra biológica en el investigador.

Véase: ADN, Biobancos, Biología molecular, Cuerpo humano, Datos genéticos, Genoma humano.

Bibliografía: FERNANDEZ, PL. / MORENTE, M. / DE ALAVA, E. Documento de consenso del programa de Bancos de Tumores de la Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (RTICC). http://www.rticcc.org/ articulos/p2/protocolos-p2/index.shtml; JOU, JM. (2003). Manual de obtención, transporte y conservación de muestras biológicas en Hematología y Hemoterapia. AEHHSETH; Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación Biomédica (2007) Boletín Oficial del Estado, 4 de julio de 2007. Madrid; NICOLÁS, P. (Ed.) Guía práctica para la utilización de muestras en investigación biomédica, (2006). Instituto Roche, Madrid: 15 y ss; RODÉS, J. / TRILLA, A., (2003), «Clinical research: from bench to bedside», Medicina Clínica (Barcelona), 121: 189-91; ROMEO CASABONA, C.M., (2008), «Muestras biológicas», en: SANCHEZ-CARO, J. / ABELLÁN, F., (Eds.), Investigación Biomédica en España. Aspectos bioéticos, jurídicos y científicos, Madrid, Fundación Salud: 233-296.